Hai người thợ sửa ống nước người Ý là Mario và Luigi đang sở hữu và vận hành công ty Super Mario Bros nhưng lại không thành công. Họ phải làm công việc kinh doanh hệ thống ống nước ở Brooklyn. Cha của họ không đồng ý với quyết định của Mario rằng anh sẽ từ bỏ công việc lương cao dưới tay tên Spike phản diện để bắt đầu kinh doanh. Sau khi nhận thấy một vụ rò rỉ miệng cống nghiêm trọng được đưa tin trên bản tin, Mario và Luigi nhanh chóng đi xuống lòng đất để sửa đường ống dẫn nước, nhưng cả hai đều bị hút vào một đường ống và đã bị chia tách ra trong quá trình này.

Mario đặt chân đến Vương quốc Nấm vùng đất được cai trị bởi Công chúa Peach, trong khi Luigi thì lại đặt chân đến Vùng đất Bóng tối, được cai trị bởi Koopa vua Bowser. Bowser cố gắng tìm mọi cách để kết hôn với Peach và sẽ tiêu diệt Vương quốc Nấm bằng cách sử dụng Siêu sao nếu cô từ chối. Bowser đã tống giam Luigi để đe doạ Mario, người mà anh coi là đối thủ cạnh tranh để có được sự ưu ái của Peach. Mario đã gặp Toad, người đã đưa anh đến gặp Peach. Peach dự định liên minh với Vương quốc Rừng xanh để giúp đẩy lùi Bowser và đồng ý đưa thêm Mario và Toad đi cùng.

Tại lâu đài của Peach, Peach đang tiết lộ kế hoạch chiêu mộ Vương quốc Kong để giúp họ chống lại Bowser, và đồng ý đưa Mario đi cùng sau khi anh gần như đã hoàn thành chướng ngại vật cùng với Toad. Trong cuộc hành trình của họ, Peach đã chia sẻ rằng cô không biết toàn bộ đến nguồn gốc của mình, cô đã được các cư dân của Vương quốc Nấm thu nhận khi còn nhỏ và cuối cùng được phong làm công chúa của họ; Mario suy đoán rằng cô cũng có thể đến từ cùng một thế giới với anh. Tại Vương quốc Kong, đức vua Cranky Kong đã đồng ý giúp đỡ với điều kiện Mario phải đánh bại con trai mình đó chính là Donkey Kong ở trong một trận chiến. Sau một khởi đầu không mấy ổn định, Mario đã phải tăng sức mạnh thành Cat Mario và đã đánh bại Donkey Kong.

Mario, Peach, Toad và Kong đều sử dụng xe kart để lái xe đến Bowser, nhưng họ lại bị quân đội của anh phục kích trên Đường Rainbow. Khi một phần của con đường bị phá hủy, Mario và Donkey Kong đã lao thẳng xuống biển và bị Maw-Ray tiêu diệt, còn những Kong khác bị bắt. Peach và Toad đã lái xe trở lại Vương quốc Nấm và kêu gọi những người dân đi sơ tán. Peach sau đó nói rằng cô sẽ kết hôn với Bowser để ngăn cho Toad khỏi bị tra tấn. Trong khi đó, Mario và Donkey Kong đã thoát khỏi Maw-Ray nhờ tên lửa từ xe kart của Donkey Kong, và đã đi đến gặp Bowser.

Tại tiệc cưới, diễn ra trước sự chứng kiến của tất cả những người bị nhốt trong lồng, Peach đã tăng sức mạnh bằng Hoa băng và đã đóng băng Bowser, trong khi những người bị nhốt được giải thoát. Toad và Donkey Kong đã giúp một phần chống lại quân đội của Bowser trong khi Mario chuyển hướng Banzai Bill ra khỏi lâu đài của Peach và vào đường ống đưa anh đến Vương quốc Nấm. Tuy nhiên, điều này sẽ khiến nó từ Vương quốc Nấm được chuyển đến Brooklyn, nơi mà Mario và Luigi có được Siêu sao và sử dụng khả năng bất khả chiến bại của nó để cùng nhau đánh bại Bowser, người sau đó đã bị thu nhỏ bằng một cây nấm và đặt trong một cái chai. Cư dân của Brooklyn ăn mừng anh em nhà Mario, bao gồm cả Spike và cha của Mario, sau đó nói rằng ông tự hào về anh. Và sau đó, Mario và Luigi đã trở thành cư dân của Vương quốc Nấm.

Trong một cảnh đội ngũ thực hiện, Bowser vẫn còn bị thu nhỏ chơi một bài hát, chỉ để bị một đám lính canh đang đánh. Trong một cảnh post-credit sau đó, một quả trứng màu trắng có đốm xanh nở ra, khi đó người ta nghe thấy tiếng của Yoshi.